پیشینه تحقیق ترانسفورماسیون و سیستم نوترکیبی مبتنی برλ-Red و معرفی و کاربرد تکنیک PCR و تشخیص آزمایشگاهی باکتری E.coli و Shigella و Vibrio Cholerae  دارای ۳۳ صفحه می باشد فایل پیشینه تحقیق به صورت ورد  word و قابل ویرایش می باشد. بلافاصله بعد از پرداخت و خرید لینک دنلود فایل نمایش داده می شود و قادر خواهید بود  آن را دانلود و دریافت نمایید . ضمناً لینک دانلود فایل همان لحظه به آدرس ایمیل ثبت شده شما ارسال می گردد.

فهرست مطالب

۱-۱ انتقال ژن در باکتری    ۵
۱-۲ ترانسفورماسیون    ۶
۱-۳  نوترکیبی    ۷
۱-۴ تعریف PCR    ۹
۱-۴-۱ کاربردهای PCR :    ۱۲
۱-۴-۲ تهیهی نسخه های متعدد از یک ژن    ۱۲
۱-۴-۳  مراحل آزمایشگاهی PCR:    ۱۲
۱-۵ Real-Time PCR ‏    ۱۳
۱-۵-۱ کاربردهای Real Time PCR    ۱۳
۱-۵-۲ اصول کارReal Time PCR    ۱۴
۱-۵-۳روش کار Real Time PCR    ۱۴
۱-۵-۴ آنالیزهای کمی در Real time PCR    ۱۵
۱-۵-۵  روش منحنی استاندارد(مقایسه مطلق)    ۱۵
۱-۵-۶ روش آستانه نسبی(مقایسه نسبی)    ۱۵
۱-۶E.coli    ۱۶
۱-۶-۱ خصوصیات عمومی    ۱۶
۱-۶-۲ تقسیم‌های دوتایی و پیاپی E.coli    ۱۷
۱-۶-۳ کاربردها    ۱۷
۱-۶-۴ تشخیص آزمایشگاهی باکتری E.coli    ۱۸
۱-۷  Shigella    ۱۸
۱-۷-۱ تشخیص آزمایشگاهی باکتری Shigella    ۱۸
۱-۷-۲ بیماری زایی    ۱۹
۱-۸  Vibrio Cholerae    ۱۹
۱-۸-۱ شناسایی و طبقهبندی    ۲۰
۱-۸-۲ فیزیولوژی    ۲۱
۱-۸-۳ عوامل موثر در بیماری زایی    ۲۱
۱-۸-۴  تأیید بیوشیمیایی    ۲۱
۱-۸-۴-۱ واکنش بر روی محیط TS  یا KIA    ۲۲
۱-۸-۴-۲ تستهای دکربوکسیلاز-دهیدرولاز    ۲۲
۱-۸-۴-۳  تست نیاز به نمک برای رشد    ۲۲
۱-۸-۴-۴ حساسیت به ترکیب ویبریواستاتیک ۱۲۹/O    ۲۲
۱-۹ رشد و نمو باکتریها    ۲۲
۱-۱۰زمان تقسیم سلولی    ۲۳
۱-۱۱ مراحل رشد و منحنی رشد باکتریها    ۲۳
۱-۱۲منحنی رشد باکتریایی    ۲۳
شکل (۱-۵) منحنی رشد باکتریایی    ۲۴
۱-۱۲-۱ مرحله ی خفته یا تاخیری (Lag phase)    ۲۴
۱-۱۲-۲ مرحله ی فعال تکثیر یا رشد و تکثیر لگاریتمی (Logphase)    ۲۴
۱-۱۲-۳  مرحله ی سکون یا تکثیر کند (Stationary phase)    ۲۴
۱-۱۲-۴ مرحله ی زوال یا مرگ (Deathphase)    ۲۵
۱-۱۳سرعت رشد و زمان نسل    ۲۵
۱- ۱۴ محاسبه زمان نسل باکتری    ۲۵
۱-۱۵ شیوههای سنجش تعداد سلول    ۲۶
۱-۱۶ محیطهای کشت:    ۲۷
۱-۱۶-۱محیط کشت مایع:    ۲۷
۱-۱۶-۲ محیط کشت جامد:    ۲۷
۱-۱۷ تاریخچه ترانسفورماسیون    ۲۸
۱-۱۸ سیستم نوترکیبی مبتنی برλ-Red    ۲۹
۱-۱۹ پلاسمید PKD46    ۳۰
فهرست منابع و مآخذ    ۳۱

منابع

Porter, M. E., Dorman, C. J, (1997), Virulence gene deletion frequency is increased in Shigella flexneri following conjugation, transduction, and transformation. FEMS Microbiol Lett, 147(1), 163-72.

Hamood, A. N., Pettis, G. S., Parker, C. D., McIntosh, M. A, ( 1986), Isolation and characterization of the Vibrio cholerae recA gene. J Bacteriol, 167(1), 375-378.

Burrus, V., Quezada-Calvillo, R., Marrero, J., Waldor, M. K, (2006), SXT-related integrating conjugative element in New World Vibrio cholerae. Appl Environ Microbiol, 72(4), 3054-7.

Yamamoto, S., Izumiya, H., Morita, M., Arakawa, E., and Watanab, H,(2009), Application of λ Red recombination system to Vibrio cholerae genetics: Simple methods for inactivation and modification of chromosomal genes. Gene 438, 57–۶۴٫

Yamamoto, K., Do Valle, G. R., Xu, M., Miwatani, T., Honda, T, (1995), Amino acids of the cholera toxin from Vibrio cholerae O37 strain S7 which differ from those of strain O1. Gene. 163(1), 155-6.

Sharan, S.K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L, (2009), Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat Protoc. 4(2), 206-23.

Michalski, J., Galen, J. E., Fasano, A,. and Kaperi, J. B, (1993), CVD110, an attenuated Vibrio cholerae 01 El Tor live oral vaccine strain. Infection and immunity, 61(10), 4462-4468.

Saleh-Gohari, N., Bryant, H. E, Schultz, N., Parker, K. M., Cassel, T. N., and Helleday, T, (2005),  Spontaneous homologous recombination is induced by collapsed replication forks that are caused by endogenous DNA single-strand breaks. Molecular and Cellular Biology, 25(16), 7158–۷۱۶۹٫

Murphy, K. C., Campellone, K. G., and Poteete, A. R, (2000), PCR-mediated gene replacement in Escherichia coli. Gene, 246, 321–۳۳۰٫

Murphy, K. C, (1988), Use of bacteriophage lambda recombination functions to promote gene replacement in Escherichia coli. J Bacteriol, 180(8), 2063-71.

Brüssow, H., Canchaya, C., Hardt, W. D, (2004), Phages and the evolution of bacterial pathogens: from genomic rearrangements to lysogenic conversion. Microbiol Mol Biol Rev, 68(3), 560-602.

Carter, D. M., Radding, C. M,  (۱۹۷۱), The role of exonuclease and beta protein of phage lambda in genetic recombination. II. Substrate specificity and the mode of action of lambda exonuclease.  Proc Natl Acad Sci U S A,  ۲۴۶(۸), ۲۵۰۲-۱۲٫

۱-۱ انتقال ژن در باکتری

در اکثر باکتری ها توراث ژنها اغلب به صورت عمودی است اما قسمت قابل توجهی از آن توسط انتقال جانبی یا عرضی بین باکتری ها انتقال می یابد. عناصر ژنتیکی متحرک مثل پلاسمیدها، باکتریوفاژها و ترانسپوزون ها به همراه تغییرات ژنی مثل حذف، اضافه شدن و ترتیب دوباره ژن ها سیر تکاملی پروکاریوتها را تسریع کرده اند و باعث ایجاد تغییرات در ژنوم  باکتری ها و در نتیجه ایجاد تنوع ژنتیکی گردیده اند. باکتری ها با توجه به داشتن ژنوم کوچکتر نسبت به یوکاریوتها توانایی بیشتری برای به اشتراک گذاشتن ژنوم­شان از طریق انتقال عرضی ژن توسط هم یوغی، ترانسداکشن[۱] و ترانسفورمیشن[۲] دارند. مهمترین فرآیند هم یوغی است که طی تمـاس مستقیـم سلول با سلول اتفاق می­افتد (Proter 1997;  Burrus 2006).

هم یوغی امکان تغیرات ژنتیکی بین باکتریها و گاه حتی بین سلولهای یوکاریوتی را امکان پذیر می سازد و اغلب توسط آن ژن های موجود بر روی « پلاسمیدهای کانژوگه» منتقل می شوند. ترانسداکشن نوع دیگری از انتقال افقی ژن است که توسط ویروس ها و باکتریوفاژها صورت می پذیرد. بعضی از باکتریوفاژها می توانند به صورت یک پروفاژ به داخل کروموزوم باکتری میزبان وارد شده و باعث لیزوژنی آن شوند. پروفاژها قسمت مهمی از اکتساب افقی ژن را در DNA بسیاری از باکتریها به خود اختصاص داده اند. گاهی اوقات باکتریوفاژها باعث انتقال قسمت های متحرک دیگری از DNA باکتری و یا قسمتی دیگر از DNA ثابت باکتری می شوند و این زمانی اتفاق می افتد که خروج فاژ به صورت دقیق صورت نگیرد. این مرحله ترانسداکشن تخصصی [۳] نامیده می شود.

سومین نحوه انتقال ترانسفورمیشن است که در آن DNA آزاد از محیط برداشته میشود. برای پایدار ماندن DNA وارد شده به ژنوم میزبان طی هر سه روش احتیاج به یک سری مراحل حمایت کننده مثل نوترکیبی یکسان[۴] می باشد. همگان قبول دارند که اکتساب توالی های جدید و توسعه ژنوم امری حیاتی برای تکامل میباشند. این که آیا ژن های اکتسابی در باکتری نگه داشته می شوند و یا این که چگونه باقی
می مانند بستگی به عملکرد آن ژنها و فشار انتخابی محیط برای نگه داشتن آن دارد .( Proter 1997)

۱-۲ ترانسفورماسیون

ترانسفورماسیون یکی از راههای انتقال توارث به سایر باکتریها میباشد. در این روش یک تکه DNA دو رشته ای آزاد در محیط به سطح یک باکتری دیگر متصل شده و تنها یک رشته آن وارد باکتری شده و در کروموزوم باکتری میزبان ادغام می شود. برای داخل شدن قطعه ای از DNA در درون کروموزوم، عملکرد اپرون UVrABCD (UV در اول اسم اپرون مخفف پرتو UVاست ) ژن rec A بر اثر عوامل مثل uv ، عوامل شیمیایی و ورود DNA  تک رشته ای به درون باکتری فعال میشود و rABCD مخفف ژنهایrecA, recB, recC  و recD میباشد) این اپرون شامل ژنهای recA, recB, recC وrecD  میباشد. فرآیند نوترکیبی[۵] بواسطه پروتئین RecA فعال میگردد. در این فرآیند، اگر DNAتک رشته ای وارد شده در باکتری، با ناحیه ای از کروموزوم تشابه داشته باشد، تعویض میگردد که این جابجایی بواسطه پروتئین RecA انجام می پذیرد. از طرفی ژنهایrecB, recC  وrecD نقش تنظیمی، با عملکرد منفی بر روی ژن recA را بازی میکنند(Hamood et al., 1986).

در حال حاضر، در آزمایشگاههای تحقیقاتی، با استفاده از این سیستم و نحوه ادغام فاژ λ وکتوری (وکتور ها مولکول‌های DNA ای هستند که برای کلون کردن قطعات DNA در سلول های میزبان به کار می‌روند) را تولید نموده اند که میزان نوترکیبی را در باکتریها افزایش میدهند. در این وکتور سه ژن exo, bet  وgam را تحت یک پروموتری که با L-arabinose تحریک می شود قرار داده اند. عملکرد این سه ژن بدین صورت است که پروتئین Exo باعث هضم نوکلئوتیدها از قسمت ۵’ انتهای DNA دو رشته ای می­شود و پروتئین Bet با حفاظت از قسمت تک رشته ای ۳’ بوجود آمده، مانع تخریب آن میگردد.  نهایتا پروتئین Gam با ممانعت از عملکرد ژنهای  recB,recC  وrecD باعث تحریک  بیان ژن recA در باکتریها می شود (شکل۱-۱).

مارکر مقاومت آنتی بیوتیکی در این وکتور آمپی سیلین بوده و از نظر تعداد پلاسمید در باکتریها، جزء پلاسمیدهای شمارش تکرار پایین[۶]محسوب میگردد. بهترین دما، برای تکثیر این وکتور ۳۰ درجه سانتیگراد بوده و در دمای ۴۲-۳۷ درجه سانتیگراد از دست میرود. بنابراین از این نظر، جزء پلاسمیدهای حساس به دما[۷]  نیز تقسیم ­بندی میگردد (Yamamoto et al., 2009). مهمترین و کاربردی ترین پلاسمید در این زمینه pKD46 بوده که قابلیت تکثیر، در dysentrieae Shigella,E.coli, Vibrio Cholerae را دارد.

۱-۳  نوترکیبی

نوترکیبی[۱] ژنتیکی فرآیندی است؛ که طی آن مولکول اسیدنوکلئیک شکسته شده و به شکل­های مختلف به یکدیگر متصل می شوند. این عمل در بیشتر مواقع مربوط به DNA و گاهی درRNA نیز دیده می شود. نوترکیبی می تواند بین کروموزوم های همولوگ باشد که به آن نوترکیبی همسان گفته می شود. نوترکیبی به طور معمول روشی برای ترمیم DNA پروکاریوت و یوکاریوت ها می باشد که در یوکاریوت ها در میوز رخ داده و به آن فرآیند کراسینگ اور می گویند. در طی آن جابه جایی کروموزوم پدر و مادری رخ می دهد و می‌تواند سبب تولید الل جدید شود. در سیستم ایمنی این فرآیند نقش بسیار مهمی را ایفا می­کند وسبب مقاومت بدن در مقابل بیماریزاهای مختلف می شود.

[۱] Transformation

[۱]Transduction

[۲] Transformation

[۳]Specialized transduction

[۴]Homologous Recombination

[۵]Recombination

[۶]low copy number

[۷]Temperature sensitive

تمامی فایل های پیشینه تحقیق و پرسشنامه و مقالات مربوطه به صورت فایل دنلودی می باشند و شما به محض پرداخت آنلاین مبلغ همان لحظه قادر به دریافت فایل خواهید بود. این عملیات کاملاً خودکار بوده و توسط سیستم انجام می پذیرد. جهت پرداخت مبلغ شما به درگاه پرداخت یکی از بانک ها منتقل خواهید شد، برای پرداخت آنلاین از درگاه بانک این بانک ها، حتماً نیاز نیست که شما شماره کارت همان بانک را داشته باشید و بلکه شما میتوانید از طریق همه کارت های عضو شبکه بانکی، مبلغ  را پرداخت نمایید.